Ul. Roepat - Historia

Ul. Roepat - Historia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Roepat

(Str: dp. 16.100; 1.466'0", b. 55'11", dr. 28'9", s. 11 k.; kpl. 70; a. 1 5", 1 3")

Roepat (Id. No. 2536), zbudowany w 1914 przez William Hamilton & Co., Ltd., Glasgow, Szkocja, do służby jako statek do transportu zwierząt Duteh, został przejęty przez amerykańskich celników, przejęty i oddany do użytku jako Naval Overseas Statek usług transportowych 17 maja 1918 w Nowym Jorku.

Po remoncie i przemeblowaniu, Roepat załadował ucho ogólnych zapasów wojskowych i popłynął 2 czerwca w konwoju do Brześcia i St. Nazaire, gdzie wyładował swój ładunek. Wrócił do Nowego Jorku w konwoju 30 lipca.

Załadowując zaopatrzenie armii w Norfolk, popłynął w konwoju z Nowego Jorku 17 sierpnia do Marsylii, gdzie dotarł 6 września, aby rozładować swój ładunek. Wrócił do Nowego Jorku 18 października, aby poddać się naprawom i załadować ładunek armii do Verdon, gdzie dotarł 18 listopada. Wróciła do Norfolk 22 grudnia.

Załadowując ładunek na konto żeglugi w Baltimore, zbunkrował się w Nowym Orleanie i wypłynął z tego ostatniego portu 5 lutego 1919 r. do Cette przez Newport News. Rozładowując swój ładunek pszenicy i zboża wysłany do rządu szwajcarskiego 4 marca, wrócił do Nowego Jorku 6 maja i przeszedł naprawę.

Roepat popłynął 24 maja do Portland w stanie Maine, gdzie załadował ładunek dla Zarządu Żeglugi i popłynął 29 maja do Amsterdamu, gdzie dotarł 28 czerwca. 30 czerwca Roe pat została wycofana ze służby i wróciła do swojej właścicielki, Nederland Stoomvaart Maats chappij.


Wprowadzenie do krótkiego powtórzenia tandemowego

Mam nadzieję, że w tych nieszczęsnych czasach wszyscy pozostaną bezpieczni i zdrowi. Moje ostatnie stanowisko dotyczyło bycia nowym absolwentem MLS i rozpoczęcia mojej kariery jako technolog molekularny w laboratorium transplantacyjnym Northwestern University. Czas zdecydowanie leci!

Dzisiaj przedstawię podstawowe wprowadzenie do testu, z którego niedawno się szkoliłem, o nazwie Short Tandem Repeat (STR). Gdybyś miał rzucić okiem na swój genom, byłby zaśmiecony wieloma powtarzającymi się sekwencjami. Chociaż istnieje wiele różnych klasyfikacji powtarzających się sekwencji, STR są rodzajem sekwencji powtarzających się tandemowo, w których każde powtórzenie ma długość około 2 do 7 nukleotydów. 1,2,3 STR jest dobrze znana w kryminalistyce, ponieważ pomaga zidentyfikować podejrzanego na miejscu przestępstwa, gdy obecne są różne źródła DNA. Jednak jego zastosowań jest wiele – od potwierdzenia linii komórkowych, testów ojcowskich, aż po analizę chimeryzmu! 4

Zdjęcie 1. Elektroforogram przedstawiający dwa różne allele (11 i 17) w 1 locus (D6S1043). Allel 11 ma 11 powtórzeń, a allel 17 ma 17 powtórzeń.

STR są polimorficzne, co stanowi jedną użyteczną cechę spośród wielu, co sprawia, że ​​ich wykorzystanie w identyfikacji źródła DNA jest szczególnie korzystne. Allel STR jest zdefiniowany przez liczbę powtórzeń określonej powyżej powtarzającej się sekwencji. (zdjęcie 1). 1 Osobniki są albo heterozygotyczne albo homozygotyczne w każdym locus. Wraz ze wzrostem liczby ocenianych loci STR, statystyczna moc rozróżniania wzrasta, a prawdopodobieństwo, że inna osoba ma ten sam profil, staje się coraz bardziej nieprawdopodobne, a wykrywanie niewielkich różnic wzrasta. 3,4 W naszym laboratorium oceniamy łącznie 21 różnych loci!

Dodatkowo w naszym laboratorium HLA wykorzystujemy STR do monitorowania stanu chimeryzmu u pacjentów, którzy przeszli allogeniczny przeszczep komórek macierzystych. Przed przeszczepem pacjenci są dopasowywani do dawcy poprzez system HLA (inny niż STR). Po potwierdzeniu zgodności HLA wykorzystujemy materiał sprzed przeszczepu pacjenta i próbkę dawcy do wygenerowania informacyjnych alleli STR. Allele informacyjne to allele obecne tylko u biorcy, a nie u dawcy. Allele te są ważne, ponieważ przeszczepy komórek macierzystych zastępują szpik biorcy, a wykrycie DNA biorcy w próbkach po przeszczepie ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji odrzucenia lub nawrotu choroby. Dodatkowo loci, które zawierają informacyjne allele są definiowane jako informacyjne loci, są to loci następnie wykorzystywane do identyfikacji procentowego chimeryzmu (zdjęcie 2).

Rysunek 2. Dawca i biorca (przed przeszczepem) są reprezentowani na pierwszych dwóch elektroforogramach. Zielone znaczniki „D1R” reprezentują wspólne allele, niebieskie znaczniki „D1” reprezentują allele specyficzne dla dawcy, a brązowe znaczniki „R” reprezentują allele specyficzne dla biorcy. W pierwszym locus, AMEL, nie ma alleli informacyjnych i dlatego nie jest locus informacyjny. W następnym locus, D3S1358, znajduje się jeden wspólny allel 15, jeden allel dawcy 17 i jeden allel informujący o biorcy 18. Loci informacyjne mają allele informujące o biorcy i mogą wykryć obecność DNA biorcy w próbce – w w tym przypadku wszystkie następujące loci po AMEL są loci informacyjne. CD3 (po przeszczepie) jest reprezentowany na trzecim elektroforogramie. W tym przykładzie jest jasne, że pacjent ma jakiś rodzaj niepowodzenia przeszczepu lub nawrotu choroby, ponieważ obecne są jego własne komórki, a nie tylko dawca.

Kiedy komórki biorcy zaczynają ponownie pojawiać się, możemy wykryć względne piki alleli i przypisać je biorcy lub dawcy, odnosząc się do alleli informacyjnych. Piki alleli są następnie wykorzystywane przez równania w naszym oprogramowaniu, które mierzą obszar pod tymi zdefiniowanymi pikami, a następnie obliczają procent chimeryzmu dawcy. Po utworzeniu tego raportu informacyjnego możemy porównać dowolne postępowanie po przeszczepieniu próbki, aby określić stan chimeryzmu pacjenta (zdjęcie 2).

Co ciekawe, nie izolujemy po prostu DNA z kożuszka po próbce, tak jak w przypadku innych próbek. Zamiast tego dzielimy każdą próbkę postu na trzy podpróbki. Pierwsza to po prostu krew obwodowa pacjenta – nic nadzwyczajnego. Pozostałe dwa są izolowane z pozostałej części krwi obwodowej, która nie została wykorzystana do dwóch oddzielnych linii komórkowych – limfocytów (CD3+) i mielocytów (CD33+). Proces ten jest niezwykle pracochłonny, ponieważ jest w stanie przetworzyć zestaw do 8-12 pacjentów na raz, a każdy zestaw zajmuje do 4-5 godzin.

Proces rozpoczyna się od podzielenia krwi obwodowej w celu izolacji DNA (próbka 1), a następnie pobrania pozostałej części i nałożenia jej na podłoże do rozdzielania limfocytów (LSM). Następnie pobranie warstwy limfocytów/białych krwinek z odwirowanego LSM. Następnie dodajemy koktajle selekcji przeciwciał CD3 i CD33 oraz kulki magnetyczne. Następnie wykonujemy serię płukań magnesami i ostatecznie otrzymujemy oczyszczone populacje komórek CD3 i CD33. Ich czystość określa się za pomocą cytometrii przepływowej, która jest ważnym elementem potwierdzającym, że nasze podzbiory leukocytów nie są zanieczyszczone innymi populacjami leukocytów – ponieważ zanieczyszczenie uniemożliwiłoby analizę różnych linii.

Na koniec pobieramy wyizolowane DNA z trzech podpróbek i amplifikujemy je za pomocą specyficznych starterów i znaczników fluorescencyjnych poprzez PCR. Następnie próbki są ładowane na urządzenie do elektroforezy kapilarnej. Instrument ten wykryje długość każdego fragmentu, określoną przez startery i powtórzenia w obrębie, i będzie w stanie zidentyfikować te fragmenty poprzez rozmiar, znaczniki fluorescencyjne, lasery i detektory. Instrument wygeneruje następnie dane, które możemy przenieść na naszą platformę analityczną, czyli ChimerMarker. Dzięki temu możemy analizować dane i generować nasze raporty kliniczne.

Choć niezwykle czasochłonny, chimeryzm specyficzny dla linii ma kluczowe znaczenie w przeszczepianiu komórek macierzystych, ponieważ dostarcza więcej informacji i jest bardziej czuły niż analiza całkowitej liczby leukocytów – jest o kilka wielkości czulszy niż analiza samej krwi obwodowej. Pozwala na wczesne wykrywanie małych populacji komórek chimerycznych, które w innym przypadku mogą pozostać niewykryte, ponieważ jeden podzbiór krwi obwodowej może „maskować” inny podzbiór, który ma rosnący odsetek komórek biorców. Jak najwcześniejsze rozpoznanie tych małych populacji chimerycznych komórek ma kluczowe znaczenie dla interwencji terapeutycznych i zmniejszenia odrzucania przeszczepów. 2,5,6

Ponadto ważne jest nie tylko ich wykrycie, ale dzięki naszej analizie możemy obliczyć procent komórek dawców i komórek biorców. Często podajemy chimeryzm procentowy (%) dawców. Na przykład, pacjent 322 dni po przeszczepie może mieć chimeryzm dawcy 96% we krwi obwodowej, 100% w linii CD33 i 73% w linii CD3. Następnie, w 364 dniu po przeszczepie, mogą one mieć 100% we krwi obwodowej, 100% w linii CD33 i 92% w linii CD3. Dwie rzeczy, na które należy zwrócić uwagę w tym przykładzie, to to, że procenty się zmieniają (w tym przypadku wzrasta chimeryzm dawcy) i że krew obwodowa wykazywała 100% chimeryzmu w drugiej próbce po 364 dniach, ale kiedy przyjrzymy się konkretnie subpopulacji CD3 po 364 dniach nadal było obecnych 8% komórek biorców (zdjęcie 3 i 4).

Zdjęcie 3. Próbki 322 dni po przeszczepie. Krew obwodowa wykazuje 96% chimeryzmu dawcy. CD3 i CD33, oczyszczone z krwi obwodowej, wykazują odpowiednio 73% i 100% chimeryzmu dawcy. Zdjęcie 4. Próbki 364 dni po przeszczepie, ten sam pacjent, co na zdjęciu 3 powyżej. Krew obwodowa wykazuje 100% chimeryzm dawcy. CD3 i CD33, oczyszczone z krwi obwodowej, wykazują odpowiednio 92% i 100% chimeryzmu dawcy.

Niektóre badania skupiały się nie tylko na trendach zmian procentowych, ale także na ich względnej konstelacji procentowej. Na przykład jedno z badań wykazało, że zwiększona liczba komórek CD3 biorcy miała zwiększony czynnik predykcyjny odrzucenia przeszczepu. Stwierdzono również, że dalsze populacje subleukocytów zwiększyły tę moc predykcyjną. 5 Co więcej, przeprowadzono kilka badań, w których analizowano chimeryzm i jego przydatność w przewidywaniu choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD). Choroba ta jest definiowana przez leukocyty dawcy atakujące leukocyty i tkanki biorcy. Dzięki tym i innym odkryciom potencjał i możliwość zastosowania monitorowania chimeryzmu są niezwykle istotne w opiece nad pacjentem podczas progresji przeszczepu. 2,5,6,7

Chociaż wszczepienie jest procesem bardzo dynamicznym, różniącym się w zależności od osoby i rodzaju choroby, monitorowanie wszczepienia jest jednym ze sposobów monitorowania i ostatecznie wpływania na podejścia terapeutyczne. 2,5,6 Jestem dumny, że mogę przyczynić się do wspaniałego zespołu na Northwestern University i staram się dowiedzieć więcej o tym procesie – zarówno klinicznym, jak i laboratoryjnym. W przyszłych artykułach mam nadzieję omówić bardziej szczegółowo proces i inne testy, które wykonujemy.

Dziękuje za przeczytanie! Do następnego razu! Bądź zdrowy i bezpieczny w tych niepewnych czasach!

  1. Technologie życia. 2014. Analiza fragmentów DNA metodą elektroforezy kapilarnej. Thermo Fisher Scientific. http://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf.
  2. Kristt D., Stein J., Yaniv I. i Klein T. (2007). Ocena chimeryzmu ilościowego wzdłużnie: względy techniczne, zastosowania kliniczne i rutynowa wykonalność. Transplantacja szpiku kostnego, 39 (5), 255-268. doi: 10.1038/sj.bmt.1705576
  3. Clark, JR, Scott, SD, Jack, AL, Lee, H., Mason, J., Carter, GI, Pearce, L., Jackson, T., Clouston, H., Sproul, A., Keen, L. , Molloy, K., Folarin, N., Whitby, L., Snowden, JA, Reilly, JT oraz Barnett, D. (2015), Monitorowanie chimeryzmu po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT): Zalecenia techniczne dotyczące stosowania technik opartych na krótkich powtórzeniach tandemowych (STR), w imieniu Zjednoczonego Królestwa Krajowej Służby Zewnętrznej Oceny Jakości Leukocytów Grupa Robocza ds. Chimeryzmu Immunofenotypowania. Br J Haematol, 168: 26-37. doi:10.1111/bjh.13073
  4. Analiza krótkich powtórzeń tandemowych w laboratorium badawczym. (2012). Pobrano 10 kwietnia 2020 z https://www.promega.com/resources/pubhub/short-tandem-repeat-analysis-in-the-research-laboratory/
  5. Breuer S., Preuner S., Fritsch G., Daxberger H., Koenig M., Poetschger U., … Matthes-Martin S. (2011). Wczesne testowanie chimeryzmu biorcy w liniach komórek T i NK w celu oceny ryzyka odrzucenia przeszczepu u pacjentów pediatrycznych poddawanych allogenicznemu przeszczepieniu komórek macierzystych. Białaczka, 26(3), 509-519. doi: 10.1038/leu.2011.244
  6. Buckingham, L. (2012). Diagnostyka molekularna: podstawy, metody i zastosowania kliniczne. Filadelfia: FA Davis Company.
  7. Rupa-Matysek J., Lewandowski K., Nowak W., Sawiński K., Gil L. i Komarnicki M. (2011). Korelacja między kinetyką chimeryzmu CD3 a występowaniem choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi u pacjentów poddawanych allogenicznej transplantacji komórek krwiotwórczych. Postępowanie transplantacyjne, 43(5), 1915-1923. doi: 10.1016/j.transproceed.2011.02.011

-Ben Dahlstrom jest niedawnym absolwentem programu NorthShore University HealthSystem MLS. Obecnie pracuje jako technolog molekularny dla Northwestern University w ich laboratorium transplantacyjnym, wykonując typowanie HLA na przeszczepach szpiku kostnego i narządów litych. Jego zainteresowania obejmują mikrobiologię, molekularną, immunologię i bank krwi.


Dyskusja

Pierwszą technologią typowania DNA wprowadzoną w połowie lat 80. był RFLP. Metoda typowania DNA RFLP obejmuje jednostki podstawowe sekwencji składające się z 30 do 100 nukleotydów, które występują w wielu powtórzeniach (VNTR). Metoda RLFP typowania DNA wymaga nienaruszonego genomowego DNA w dużych ilościach (20 do 30 mg). Jednak próbki biologiczne otrzymane w laboratorium medycyny sądowej są zwykle atakowane przez środowisko i czasami można uzyskać tylko niewielkie ilości DNA. Stąd w wielu sytuacjach nie można było zastosować metody RFLP.

Obecnie stosowaną metodą typowania DNA jest typowanie STR. W tej metodzie wiele loci składających się z jednostek rdzeniowych nukleotydów powtarzanych do długości od 80 do 400 par zasad może być wspólnie amplifikowanych, a wyniki można uzyskać tego samego dnia za pomocą zautomatyzowanej analizy fragmentów DNA. Ta technologia jest lepsza niż metoda RFLP, ponieważ wymaga niewielkich ilości DNA (0,5 do 1 ng) i można również testować próbki zdegradowane.

Analiza DNA odegrała zasadniczą rolę w uzyskiwaniu wyroków skazujących za setki brutalnych przestępstw, od zabójstw po napaści. Pomogła również wyeliminować podejrzanych i doprowadziła do oczyszczenia z zarzutów i zwolnienia wcześniej skazanych osób. DNA może skoncentrować dochodzenia i prawdopodobnie skróci procesy i doprowadzi do przyznania się do winy. Może również zniechęcić niektórych przestępców do popełniania poważnych przestępstw. Zwiększone wykorzystanie kryminalistycznych dowodów DNA doprowadzi do długoterminowych oszczędności dla wymiaru sprawiedliwości w sprawach karnych.

Dzięki przechowywaniu danych DNA w komputerowych bankach danych analiza DNA może być wykorzystywana do rozwiązywania przestępstw bez podejrzanych. Naukowcy medycyny sądowej mogą porównywać profile DNA próbek dowodów biologicznych z bankiem danych, aby pomóc policji w wykrywaniu podejrzanych. Bank danych umożliwiłby również wyjaśnienie nierozwiązanych wcześniejszych przestępstw, w przypadku których znaleziono dowody DNA, ale niezwiązane ze sprawcą, gdyby próbki DNA pobrane od podejrzanego w związku z późniejszym przestępstwem były zgodne z dowodami znalezionymi na miejscu wcześniejszego przestępstwa . Krajowy bank danych DNA pomógłby również policji w identyfikowaniu seryjnych przestępców zarówno w kraju, jak i w całym kraju.

Na całym świecie przeprowadza się kryminalistyczne analizy DNA. W związku z tym ze strony krajów rozwijających się, w tym Malezji, konieczne jest opracowanie i skompilowanie krajowej bazy danych DNA składającej się z „wskaźnika profilu DNA miejsca przestępstwa”, „wskaźnika profilu DNA skazanych przestępców” oraz indeksu zawierającego profile DNA niezidentyfikowane ciała i części ciała. Ten wysiłek z kolei zagwarantuje wprowadzenie odpowiednich zmian w prawie karnym, aby pomóc organom ścigania zidentyfikować osoby podejrzane o popełnienie poważnych i brutalnych przestępstw oraz umożliwić pobieranie próbek do bazy danych profilowania DNA. Do tej pory opublikowano już dane dla 9 STR dla trzech grup etnicznych Malezji (Malay, Chińczycy i Hindusi) (21, 22) i obecnie trwają starania o typowanie subpopulacji Malajów i rozpoczęcie nowo zwalidowanego profilowania 15 STR zestaw w różnych populacjach w Malezji. Rozbudowana baza danych i profilowanie DNA przestępców oraz ich indeksowanie pomogą przyspieszyć wykrywanie przestępstw.


Jak działa dowód DNA

Z miejsca zbrodni fragment DNA trafia do laboratorium kryminalistycznego. Te laboratoria znacznie się różnią, zarówno pod względem struktury, jak i rodzaju analiz, które oferują. Laboratoria publiczne są często powiązane z organami ścigania lub prokuraturą okręgową, podczas gdy inne są niezależnymi jednostkami rządowymi. Istnieją również prywatne laboratoria kryminalistyczne, niektóre poświęcone tylko analizie DNA.

Wiele laboratoriów ma możliwość przeprowadzania testów na jądrowym DNA, który jest kopią DNA, która znajduje się w jądrze każdej komórki. Ale tylko kilka laboratoriów oferuje bardziej wyspecjalizowane techniki, takie jak analiza chromosomu Y lub mitochondrialnego DNA. Przyjrzyjmy się niektórym z tych technik bardziej szczegółowo.

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) analiza była jedną z pierwszych metod kryminalistycznych stosowanych do analizy DNA. Analizuje długość nici DNA, które zawierają powtarzające się pary zasad. Te powtórzenia są znane jako zmienna liczba powtórzeń tandemowych (VNTR), ponieważ mogą się powtarzać od jednego do 30 razy.

Analiza RFLP wymaga od badaczy rozpuszczenia DNA w enzymie, który rozrywa nić w określonych punktach. Liczba powtórzeń wpływa na długość każdej powstałej nici DNA. Badacze porównują próbki, porównując długości pasm. Analiza RFLP wymaga dość dużej próbki DNA, która nie została zanieczyszczona brudem.

Wiele laboratoriów zastępuje analizę RFLP krótkie powtórzenie w tandemie (STR) analiza. Ta metoda ma kilka zalet, ale jedną z największych jest to, że można zacząć od znacznie mniejszej próbki DNA. Naukowcy wzmacniają tę małą próbkę w procesie znanym jako reakcja łańcuchowa polimerazy, lub PCR. PCR tworzy kopie DNA, podobnie jak DNA kopiuje się w komórce, wytwarzając prawie każdą pożądaną ilość materiału genetycznego.

Po amplifikacji danego DNA, analiza STR sprawdza, jak często pary zasad powtarzają się w określonych loci lub lokalizacjach na nici DNA. Mogą to być powtórzenia dinukleotydowe, trinukleotydowe, tetranukleotydowe lub pentanukleotydowe – czyli powtórzenia dwóch, trzech, czterech lub pięciu par zasad. Badacze często szukają powtórzeń tetranukleotydowych lub pentanukleotydowych w próbkach, które przeszły amplifikację PCR, ponieważ są one najprawdopodobniej dokładne.

Federalne Biuro Śledcze (FBI) wybrało 20 konkretnych loci STR, które mają służyć jako standard analizy DNA. Rozszerzyli tę liczbę z 13 do 20 w styczniu 2017 r.


Typowanie STR: metoda i zastosowania

W tym miesiącu wyprawa The Primer do technik diagnostyki molekularnej obejmie metodę znaną jako typowanie krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Typowanie STR jest metodą najczęściej stosowaną do pracy w kryminalistyce molekularnej, ale jest coraz częściej stosowana również w laboratorium patologii molekularnej jako metoda do wykorzystania (lub powrotu, w razie potrzeby) do śledzenia i/lub potwierdzania „tożsamości” tkanki próbki. Podczas gdy pierwsza aplikacja ma więcej czasu na ekranie w telewizji i filmach, to w drugim kontekście więcej czytelników prawdopodobnie napotka tę metodę. Jednak, jak zobaczymy, rzeczywista metoda jest identyczna w obu zastosowaniach.

Zrozumienie krótkich powtórzeń tandemowych

Zaczynamy od rozważenia, czym właściwie jest STR. W całym genomie człowieka występuje duża liczba miejsc („loci”), w których niekodujące sekwencje DNA składają się z krótkiego (zwykle 3 lub 4) elementu nukleotydowego, takiego jak „CGG” lub „ACAG”, który występuje jako zestaw powtórzeń konkatamerycznych. W naszych przykładach będzie to odpowiednio „CGGCGGCGG….CGG” i „ACAGACAGACAG….ACAG”. Kiedy replikacja DNA zachodzi przez tego typu elementy, może wystąpić szczególny rodzaj błędu: jeśli powstająca (rosnąca) nić zostanie chwilowo odłączona od matrycy, kiedy ponownie przyłączy się, może to skutecznie zrobić z „poślizgiem” o pewną jednostkę liczba powtórzeń, pozwalająca na ponowne ustanowienie prawie wszystkich par zasad. Oznacza to, że po denaturacji i ponownym przyłączeniu powstającej nici do matrycy polimeraza może znajdować się „przed” lub „za” miejscem, w którym była, gdy opuściła. Gdy replikacja rozpoczyna się od nowa, powstająca nić albo „przeskakuje” niektóre powtórzenia szablonu, albo odczytuje je jako szablon dwukrotnie. Pierwsza daje potomną nić DNA z utratą jednostkowej liczby powtórzeń STR, podczas gdy druga daje potomną nić ze zwiększoną liczbą powtórzeń STR.

Jak często ten „poślizg” polimerazy występuje w regionie STR? Częstotliwość może się różnić w zależności od wielu czynników, ale ogólna odpowiedź brzmi: rzadka, ale na tyle często, że populacja będzie wykazywać zakres liczby powtórzeń STR w danym locus.

Chociaż loci STR występują rozproszone w całym ludzkim genomie, ich niewielka liczba jest szczególnie dobrze poznana. Są to te, które występują w regionie oflankowanym przez wysoce konserwatywne unikalne sekwencje, tak że unikalne sekwencje nie są zbyt blisko siebie ani zbyt daleko od siebie, dla efektywnej amplifikacji PCR opartej na starterach przeciwko unikalnym regionom (około 50 do 500 zasad pary). Gdy taki element STR istnieje, możliwe jest zaprojektowanie starterów PCR przeciwko flankującym konserwatywnym regionom i wiedza, że ​​(dzięki konserwacji) zestaw starterów będzie amplifikował produkt z dowolnej nienaruszonej próbki ludzkiego DNA. W rzeczywistości, gdy loci STR, o których mowa, znajdują się w autosomie, jak większość, wtedy próbka ludzkiego DNA będzie miała dwie kopie loci (jedna z DNA pochodzącego od matki, jedna z DNA pochodzącego od ojca), więc dwa produkty PCR zostaną zamplifikowane. Ważnym szczegółem jest to, że chociaż wiemy, że powstanie produkt PCR (lub dwa produkty), nie wiemy apriorycznie jak długo będą produkty. Ta długość będzie zależeć od liczby powtórzeń STR pomiędzy miejscami starterów PCR. Najbardziej użyteczne loci STR to te, w których badania populacyjne wykazały dużą różnorodność liczby napotkanych powtórzeń – powiedzmy od 5 do 30. Ten zakres 25 „liczby powtórzeń” dla elementu powtórzenia trinukleotydowego prowadziłby do zakresu 75 par zasad ( tj. 25 x 3) możliwych rozmiarów amplikonu, w krokach co trzy zasady na powtórzenie.

Znane pod nazwami loci, takimi jak „D1S80” lub czasami dla pobliskich genów „TPOX”, szczególna garstka loci STR spełnia te kryteria użyteczności i jest dobrze zbadana, z opublikowanymi zestawami starterów do ich amplifikacji i znanymi statystykami populacyjnymi dla poszczególnych liczb powtórzeń w każdym locus — to znaczy, dla locus, w danej populacji etnicznej, niektóre powtarzające się liczby są powszechnie spotykane, a inne rzadziej.

Znalezienie odcisku palca DNA

Mając to na uwadze, wyobraźmy sobie, że bierzemy zestaw starterów dla autosomalnego locus STR i przeprowadzamy prostą reakcję PCR punktu końcowego na ludzkiej próbce. Pod koniec PCR analizujemy produkty PCR pod kątem wielkości. Ponieważ szukamy kroków 3-nt lub 4-nt, elektroforeza żelowa nie zapewni nam wystarczająco dobrej rozdzielczości, aby odróżnić produkty różniące się jedną lub dwiema liczbami powtórzeń, dlatego używamy sekwencerów elektroforezy kapilarnej, aby dokładnie odczytać rozmiary produktów nukleotyd. Nasza próbka może pokazywać produkt o jednym rozmiarze (wskazując, że obie kopie loci miały tę samą liczbę powtórzeń) lub może przedstawiać dwa produkty różniące się liczbą powtórzeń (Rysunek 1). Dla zbadanych loci znamy teraz liczbę powtórzeń związanych z tą próbką DNA.

Teraz wyobraź sobie, że pobieramy drugą próbkę DNA i powtarzamy eksperyment. Jeśli to zrobimy i otrzymamy inny wynik niż w przypadku pierwszej próbki, mamy nieunikniony wniosek, że dwie próbki DNA pochodzą od różnych osób. Jeśli zamiast tego otrzymamy te same wyniki, co pierwsza próbka, nie możemy jednak powiedzieć, że próbki pochodzą od tego samego osobnika. Jest tak, ponieważ jest możliwe (do pewnego poziomu statystycznego, w zależności od częstości populacji wyniku uzyskanego dla tego locus), że inna osoba miała takie same liczby powtórzeń jak te loci.

Technika nabiera mocy, gdy testujemy wiele loci STR w każdej próbce. Prawdopodobieństwo dokładnego dopasowania dwóch próbek spada szybko, gdy badamy więcej loci. Jeden powszechnie stosowany komercyjny test STR bada 16 loci (15 autosomalnych i jeden szczególny przypadek chromosomów płci omówionych poniżej) z deklarowanymi wskaźnikami specyficzności (tj. prawdopodobieństwem, że dwie osoby pasują do wszystkich loci) wynoszącym 1 na 1,8 × 10 17 osób lub więcej — to jest wielokrotnie całkowita populacja ludzi na planecie! Powszechnie określany jako „odcisk palca DNA” z prawdopodobieństwem tej skali, nic dziwnego, że dowody DNA są coraz częściej stosowane w kryminalistyce i przestępstwach – zarówno w popularnych rozrywkach, jak i w kryminalistyce z prawdziwego życia.

Znaczące relacje

Oprócz określenia (lub obalenia) identyczności między dwiema próbkami technikę tę można również wykorzystać do określenia pokrewieństwa. Połowa liczby powtórzeń loci STR każdego osobnika powinna odpowiadać wartościom ze źródła matczynego, a druga połowa ze źródła ojcowskiego. Rodzeństwo powinno generalnie dopasowywać się do siebie pod względem jednej czwartej loci i tak dalej, dzięki prostym relacjom genetycznym Mendla. Szczegółowa analiza statystyczna (w tym częstość populacji zaobserwowanych poszczególnych typów STR) może być wykorzystana do udoskonalenia danych tego rodzaju i udowodnienia lub obalenia poziomów pokrewieństwa między próbkami ze znanym prawdopodobieństwem statystycznym. Zauważ, że od de novo Mogą wystąpić zdarzenia poślizgu STR i/lub błędy eksperymentalne, pojedyncze niedopasowanie do wartości oczekiwanych nie obala definitywnie pokrewieństwa, dopasowanie w pozostałych loci może nadal wystarczyć, aby mieć wysoką pewność pokrewieństwa.

Teraz, gdy rozumiemy, jak ta metodologia jest stosowana w popularnych aplikacjach, co z bardziej przyziemnymi? Siła i prostota metody STR „odcisków palców” w połączeniu z łatwą dostępnością w gotowych, zoptymalizowanych formatach zestawów, które można łatwo uruchomić na sprzęcie laboratoryjnym, który jest już powszechnie dostępny w laboratorium patologii molekularnej, czyni ją użytecznym narzędziem do śledzenia i/lub potwierdzania pokrewieństwa w próbkach (lub kawałkach próbek). Rozważ przypadek, taki jak potencjalna biopsja guza, gdzie wiele małych fragmentów tkanki może być osadzonych w jednym bloku FFPE. Przeprowadzana jest rutynowa analiza immunohistochemiczna, a wynik pokazuje, że większość fragmentów tkanki nie jest rakowa, podczas gdy jeden mały kawałek jest. W takich przypadkach, patolog może niepokoić się, czy wszystkie fragmenty tkanki faktycznie pochodzą z tej samej próbki – czy też „mętlik” z innego przypadku w jakiś sposób dostał się do bloku? Takie przypadki, choć starannie chronione, nie są niemożliwe i mogą mieć poważne konsekwencje dla pacjenta. Metoda typowania STR może być bardzo użytecznym narzędziem w przypadku takim jak ten, w którym mikroskopijny skrawek danego fragmentu tkanki może służyć jako szablon dla jednego odcisku palca DNA, z próbką referencyjną od pacjenta dostarczającą drugą. Dopasowanie potwierdza „powiązanie” (lub nie) fragmentu tkanki i pacjenta, zapewniając prawidłowo przypisaną diagnozę.

Powyżej wspomniano o konkretnym locus STR na chromosomach płci. Występujący w genie amelogeniny, nie jest to ściśle klasyczna STR, w której wielkość elementu powtórzenia może się różnić, okazuje się, że wersja genu amelogeniny jest przenoszona na chromosomie X (AMELX dwukrotnie u kobiet i raz u mężczyzn) nie jest dokładnie identyczna pod względem długości z tym samym regionem genu amelogeniny niesionym na chromosomie Y (raz AMELY u mężczyzn). Intron w AMELY zawiera 6-zasadową insercję w stosunku do tego samego intronu w AMELX. (Zauważ, że ponieważ wstawienie znajduje się w intronie, kodujące części genu są identyczne.) Po amplifikacji przez startery flankujące ten region, produkty pochodzące z AMELY są zatem o 6 pz dłuższe niż pochodzące z AMELX. Najpowszechniej stosowany zestaw starterów dla tego locus daje zatem pojedynczy produkt o wielkości 106 bp (dwie kopie loci, tej samej wielkości) dla próbek DNA od samic i dublet 106/112 bp (po jednym z każdego locus) od samców. W ten sposób ten pojedynczy test locus skutecznie wyklucza (lub wyklucza) około połowy populacji jako możliwe źródła każdej danej próbki DNA i jest rutynowo włączany do paneli typowania STR. Biorąc pod uwagę jego rozmiar, ten locus jest również ledwo odróżnialny na żelu agarozowym z dobrą techniką, co czyni go dobrą demonstracją w klasie ogólnego podejścia, bez konieczności dostępu do instrumentu sekwencera kapilarnego.

A co z mieszanymi próbkami? Opisana powyżej metoda zakłada, że ​​każda testowana próbka pochodzi z jednego źródła i działa najlepiej w tej „idealnej” sytuacji. Jednak w rzeczywistych przypadkach, w których obecne są niewielkie proporcjonalne ilości innego DNA, metoda nadal działa. Podstawowy szablon da większość produktu, z niewielkimi ilościami produktu wynikającymi z zanieczyszczającego szablonu. Sekwenatory kapilarne pokazują rzeczywistą powierzchnię piku dla każdego wykrytego produktu, więc próbka pierwotna pokaże główny zestaw pików z małymi pikami bocznymi przypisywanymi zanieczyszczeniu.

Wrócić do Rysunek 1: szkic hipotetycznych wyników STR dla czterech znaczników STR „A”, „B”, „C” i „D”. Próbki 1, 2 i 3 reprezentują trzy różne próbki testowane pod kątem tych markerów, jak wynika z elektroforezy surowej kapilarnej. Każda próbka zawiera dwa wzorce o stałej wielkości, „R1” i „R2”, które służą do zapewnienia wyrównania wyników między próbkami. Każdy elektroforogram sam pokazuje siłę sygnału w stosunku do rozmiaru produktu i jest podzielony na regiony „A”, „B”, „C” i „D”. Każdy region reprezentuje oczekiwany zakres możliwych rozmiarów amplikonu z markera STR o tej samej nazwie. Biorąc pod uwagę Próbkę 1, można zauważyć, że źródło jest heterozygotyczne dla rozmiarów STR przy markerach A, C i D (dwa różne produkty utworzone przy określonych rozmiarach), ale jest homozygotyczne dla obu alleli markerowych B. (Istnieją dwa produkty, ale identycznej wielkości, dające pojedynczy pik.) Próbka 2 miałaby bardzo niskie pokrewieństwo genetyczne z próbką 1 zauważ, że w tej próbce markery STR B, C i D są heterozygotyczne, podczas gdy A jest homozygotyczne, i że na ogół niewiele z dowolnych rozmiarów alleli pokrywa się między Próbkami 1 i 2. W przeciwieństwie do tego, Próbka 3 jest dokładnie taka sama jak Próbka 1, co sugeruje identyczność (lub przynajmniej wysoki stopień pokrewieństwa). Rzeczywisty wynik STR byłby podobny do tego, ale z większą liczbą markerów, co pozwoliłoby na większą moc statystyczną w wykrywaniu braku pokrewieństwa.

dr John Brunstein, członek MLO Editorial Advisory Board, jest prezesem i CSO firmy PathoID, Inc. z siedzibą w Kolumbii Brytyjskiej.


Ul. Roepat - Historia

Większość naszego DNA jest identyczna z DNA innych. Istnieją jednak odziedziczone regiony naszego DNA, które mogą się różnić w zależności od osoby. Różnice w sekwencji DNA między osobnikami określane są jako „polimorfizmy”. Jak dowiemy się w tym ćwiczeniu, sekwencje o najwyższym stopniu polimorfizmu są bardzo przydatne do analizy DNA w sprawach sądowych i badania ojcostwa. Działanie to opiera się na analizie dziedziczenia klasy polimorfizmów DNA znanych jako „krótkie powtórzenia tandemowe” lub po prostu STR.

STR to krótkie sekwencje DNA, zwykle o długości 2-5 par zasad, które są powtarzane wielokrotnie w sposób głowa-ogon, tj. sekwencja 16 pz „gatagatagatagata” reprezentowałaby 4 kopie typu głowa-ogon tetrameru „gata” . The polymorphisms in STRs are due to the different number of copies of the repeat element that can occur in a population of individuals.

D7S280

D7S280 is one of the 13 core CODIS STR genetic loci. This DNA is found on human chromosome 7. The DNA sequence of a representative allele of this locus is shown below. This sequence comes from GenBank, a public DNA database. The tetrameric repeat sequence of D7S280 is "gata". Different alleles of this locus have from 6 to 15 tandem repeats of the "gata" sequence. How many tetrameric repeats are present in the DNA sequence shown below? Notice that one of the tetrameric sequences is "gaca", rather than "gata".


TH01

We have made and will continue to make great efforts to ensure the accuracy and completeness of the data included in this STR database. Information will be added from time-to-time to keep this site as up-to-date as possible. The National Institute of Standards and Technology (NIST) is in no way responsible for information provided through this site, including hyperlinks to commercial sources of materials. Certain commercial vendors are identified in this web site to benefit the DNA typing community. In no case does such identification imply a recommendation or endorsement by NIST nor does it imply that the material, instrument or equipment identified is necessarily the best available for human identity testing.

All users agree that all access and use of this web site and on any site linked to this one and the content thereof is at their own risk. Neither NIST nor the webmaster for the STR DNA Internet Database assume responsibility or liability for the content of pages outside of this web site.


The Geriatric Patient

Steven J. Schwartz MD , Frederick E. Sieber MD , in Anesthesia and Uncommon Diseases (Sixth Edition) , 2012

Diagnosis and Differential

The DNA-repeat expansion forms the basis of a diagnostic blood test for the disease gene. Patients having 38 or more CAG repeats in the Huntington's disease gene have inherited the disease mutation and will eventually develop symptoms if they live to an advanced age. Each of their children has a 50% risk of also inheriting the abnormal gene a larger number of repeats is associated with an earlier age at onset. Huntington's can also be diagnosed by caudate atrophy on magnetic resonance imaging (MRI) in the context of an appropriate clinical history.

Differential diagnosis of Huntington's disease includes other choreas, hepatocerebral degeneration, schizophrenia with tardive dyskinesia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and other primary dementias and drug reactions.


Performing STR Analysis

This method differs from RFLP since in STR analysis DNA is not cut with restriction enzymes. Probes are attached to preferred regions on the DNA, and a PCR is employed to discover the lengths of the short tandem repeats.

The whole process for STR typing comprisesof collection of sample, extraction of DNA, quantisation of DNA, amplification of multiple STR loci by PCR, separation and sizing of STR allele, STR typing followed by profile interpretation, and possibly a report of the statistical significance of a match. Current forensic systems apply 10 (e.g. United Kingdom) or 13 (e.g. United States) STR loci. Kits with PCR primers for the standard STR loci are available commercially.

Numerous PCR reactions are performedconcurrently in a single tube at different STR loci, which give several products (two for each locus). The required components are as follows:

§ A DNA sample, e.g. blood or buccal cells from a suspect or a tissue, hair, nail from the scene of a crime

§ Two oligonucleotide PCR primers: one unlabelled reverse primer and one primer labelled at the 5 ′ -end with 32 P

§ A DNA polymerase (thermos table)

§ Four deoxynucleoside triphosphates which are as follows: dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

The labelled PCR products separate according to size when run on a polyacrylamide gel. DNA ladder is obtained and works as characteristic of an individual (Fig.7) .



Repeat specific rows or columns on every printed page

If a worksheet spans more than one printed page, you can label data by adding row and column headings that will appear on each print page. These labels are also known as print titles.

Follow these steps to add Print Titles to a worksheet:

On the worksheet that you want to print, in the Page Layout tab, click Print Titles , w Ustawienia strony group).

Notatka: The Print Titles command will appear dimmed if you are in cell editing mode, if a chart is selected on the same worksheet, or if you don’t have a printer installed. For more information about installing a printer, see finding and installing printer drivers for Windows Vista. Please note that Microsoft has discontinued support for Windows XP check your printer manufacturer's Web site for continued driver support.

Na Arkusz tab, under Print titles, do one—or both—of the following:

w Rows to repeat at top box, enter the reference of the rows that contain the column labels.

w Columns to repeat at left box, enter the reference of the columns that contain the row labels.

For example, if you want to print column labels at the top of every printed page, you could type $1:$1 w Rows to repeat at top skrzynka.

Wskazówka: Możesz także kliknąć Collapse Popup Window buttons at the right end of the Rows to repeat at top oraz Columns to repeat at left boxes, and then select the title rows or columns that you want to repeat in the worksheet. After you finish selecting the title rows or columns, click the Collapse Dialog button again to return to the dialog box.

Notatka: If you have more than one worksheet selected, the Rows to repeat at top oraz Columns to repeat at left boxes are not available in the Ustawienia strony Okno dialogowe. To cancel a selection of multiple worksheets, click any unselected worksheet. If no unselected sheet is visible, right-click the tab of a selected sheet, and then click Ungroup Sheets on the shortcut menu.